關(guān)鍵詞：BSA、流動模式、高分辨率粒徑測試

傳統(tǒng)納米粒度儀基于動態(tài)光散射技術(shù)，使用一束激光照亮樣品，通過光電檢測器檢測懸浮在液體中顆粒的布朗運(yùn)動造成的散射光的波動。原始的散射光光強(qiáng)隨時間的波動信號通過相關(guān)性計算得到體系的相關(guān)曲線，進(jìn)而通過不同的數(shù)學(xué)模型，如累積法或者多指數(shù)法得到顆粒的粒徑和粒徑分布。納米粒度儀廣泛采用比色皿測試模式（文獻(xiàn)中常稱作batch mode），對于寬分布樣品的粒徑分布分辨率較低，且分布結(jié)果極度依賴于算法，極限分辨只能達(dá)到區(qū)分粒徑相差2.5-3倍的窄分布單獨(dú)組分，這極大地限制了粒徑分布結(jié)果的定量性。

動態(tài)流動模式通過與前端分離設(shè)備相連接使用，分別檢測每一個流出組分的粒徑，原則上講每一個流出組分都是單分散或接近單分散的，再通過濃度檢測器得到的信號，就得到了不依賴于算法的真實(shí)粒徑分布，其分辨率可以達(dá)到或者優(yōu)于1.2倍粒徑分辨率。

在本應(yīng)用中，我們將BeNano主機(jī)與SEC前端相連接，檢測了BSA的粒徑和粒徑分布信息。

原理和設(shè)備

采用丹東百特儀器有限公司的BeNano 180 Zeta Pro納米粒度及Zeta電位分析儀，儀器使用波長671 nm，功率50 mW激光器作為光源，在173°進(jìn)行光散射信號收集。測試使用了27μL 低容量流通池作為樣品池。利用BFC-1信號采集器收集前端SEC設(shè)備的示差折光檢測器的輸出。

樣品制備和測試條件

在PBS緩沖溶液中，配置濃度為5mg/mL的BSA溶液，通過前端SEC（含有RI檢測器）進(jìn)行進(jìn)樣，分離。分離后的樣品組分逐一進(jìn)入BeNano進(jìn)行粒徑檢測。

測試結(jié)果和討論

圖1. BSA樣品光強(qiáng)、RI和粒徑流出曲線

由圖1中流出曲線可以看出，BSA流出曲線為多峰曲線。較早的流出峰（6分鐘左右）為團(tuán)聚物峰，8-10分鐘為被分離的寡聚體峰。由于后一個主峰為BSA的單體峰，可以依次推測出之前的峰分別為二聚體、三聚體和四聚體峰。主峰面積較大，說明大部分蛋白為單體。由粒徑流出曲線（紅點(diǎn)）可以看出，檢測到的粒徑從大到小逐漸流出，這與SEC分離的原理相一致！這既證明了前端SEC對于樣品分離效果良好，也證明了BeNano作為SEC的一個檢測器，有效得到了各個流出組分的粒徑信息。

圖2.BSA樣品柱狀光強(qiáng)分布曲線

圖3.BSA樣品光強(qiáng)分布曲線連線圖

圖2和圖3中，將色譜流出曲線轉(zhuǎn)化為粒徑光強(qiáng)分布曲線，可以通過曲線中看出明顯被分離的寡聚體粒徑，其中單體為7.16nm，這與BSA理論單體尺寸（~7nm）具有極好的符合度。其他組分的尺寸和面積列于表1中。

表1. BSA分布峰結(jié)果

圖4.單機(jī)模式BSA樣品光強(qiáng)分布曲線圖

圖5. 單機(jī)測試（連線圖）和流動模式測試（柱狀圖）粒徑光強(qiáng)分布曲線